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커피박 추출물의 클로로겐산 함량에 따른 콩과 식물의 생장 및 토양 미생물 변화 양상에 대한 연구
이동욱, 전나현, 김준, 김태욱, 이희율(인천과학고등학교)
R&E '생물'부문 최우수 수상팀(지도교사 안지혜)
1. 이야기를 시작하며
안녕하세요! 저희는 '커피박 추출물의 클로로겐산 함량에 따른 콩과 식물의 생장 및 토양 미생물 변화 양상에 대한 연구'를 진행한 인천과학고등학교 1학년 이동욱, 전나현, 김준, 김태욱, 이희율입니다. 이 글을 통해 저희의 연구 내용과 여러 뒷이야기들을 들려드리려고 합니다.
2. 연구 주제 선정 과정
R&E의 분과로는 수학, 물리학, 화학, 생명과학, 지구과학, 정보, 융합, 공학으로 총 8가지가 있습니다. 다행히 저희 R&E 팀원 5명 모두 생명과학 분과를 희망하였기에 분야를 정하는 것에는 큰 문제를 겪지 않았지만, R&E와 같은 큰 규모의 연구는 모두가 처음이었기에 주제를 정하는 것에서 많은 시간이 소요되었습니다. 팀원 모두가 찬성한 보기에는 괜찮은 주제가 정해지더라도, 실제로 우리 학교에서 진행 가능한 연구인지, 준비물을 충분히 구할 수 있는지, 예산을 초과하지는 않는지 등의 여러 가지 조건들을 모두 만족시켜야 했습니다. 여러 선행연구를 찾아보며 주제를 찾던 중 커피박의 폴리페놀 성분이 식물 생장에 도움을 준다는 내용을 알게 되었습니다. 저희는 이것이 폴리페놀의 항산화 작용 덕분에 일어나는 현상이라고 판단하여 더 많은 자료들을 찾아보았습니다. 그 결과, 폴리페놀의 83%를 차지하고, 높은 항산화 작용을 할 수 있는 클로로겐산(chlorogenic acid) 에 주목하게 되었습니다.
저희는 클로로겐산의 함량이 높아질수록, 항산화 작용이 더 활발하게 일어날 것이고, 이는 식물 생장에 긍정적인 영향을 미칠 수 있을 것이라는 가설을 세우게 되었습니다. 또한 현재 사용되고 있는 기존의 고형 커피박 비료는 발효 공정을 필수적으로 거치게 되는데, 이 과정에서 폴리페놀이 영향을 받아 항산화 작용을 제대로 하지 못하게 되어 식물 영양제로서의 효과는 미미한 편입니다. 그래서 발효를 거치지 않는, 커피박 추출물을 이용한 액상 형태의 식물 영양제를 제작할 수 있을 것이라는 생각이 들었고, 그 가능성을 확인하기 위한 연구를 계획하게 되었습니다. 식물 생장 정도를 비교하는 실험에서 사용할 식물은 콩과 식물로 정하였습니다. 비교적 단기간에 진행되는 연구인만큼, 생장 기간이 짧은 식물을 선정한 것입니다. 또한 기존의 모든 선행연구에서는 커피박 추출물을 가했을 때의 토양 마이크로바이옴 분석을 진행하지 않았습니다. 그래서 저희 팀은 선행연구와의 차별점을 둘 수 있도록 커피박 추출물을 가한 식물 재배 토양의 미생물 변화 양상에 대한 연구를 진행하였습니다. 최종적으로, 저희 R&E팀은 '커피박 추출물의 클로로겐산 함량에 따른 콩과 식물의 생장 및 토양 미생물 변화 양상에 대한 연구'를 주제로 확정하였습니다.
3. 선행연구 분석
먼저 커피박이 식물 생장에 도움을 줄 수 있다는 내용을 찾은 뒤에, 커피박에 함유된 항산화 물질에 관한 연구를 주제로 한 논문을 많이 찾아보았습니다. 커피박 추출물의 총 폴리페놀 함량을 측정한 연구, 커피박 추출물의 항산화능을 측정한 연구, 커피박의 항균 활성도를 분석한 연구 등을 참고하여 실험 과정을 계획하였습니다. 기존의 연구들은 보통 비슷한 종류의 커피 원두를 사용하였기에 다른 원두들은 아예 관련 연구가 진행되지 않은 상황이었습니다. 또한 항산화 작용을 하는 폴리페놀 물질 중 정확히 어떤 것이 영향을 미치는지에 관한 연구가 부족하였습니다.
4. 실험 과정&결과
저희가 실험에 사용한 커피 원두는 온두라스 S.H.G., 인도네시아 만델링, 케냐 AA, 베트남 로부스타입니다. 선행연구가 많이 진행되지 않았거나, 특별히 폴리페놀 연구에 많이 사용되었던 원두들을 종합하여 총 4종의 원두를 사용하였습니다.
저희는 먼저 커피박 추출물이 실제로 식물 생장에 영향을 주는지 실험하기 위해 사전 연구를 진행하였습니다. 생장 기간이 짧고, 생장 정도를 한눈에 볼 수 있는 콩나물을 초기 연구 대상으로 결정하였습니다. 각기 다른 농도의 커피박 추출물을 주입하여 5일간 생장시킨 결과 콩나물의 생장 정도에 큰 차이가 있는 것을 확인하였고, 팀원들 모두 연구가 제대로 이루어지고 있다는 생각에 안심이 되었던 것 같습니다. 이에 힘입어, 조금씩 서로의 의견을 맞춰가며 팀으로써 하나가 될 수 있었습니다.
본 연구는 다음과 같은 순서로 진행하였습니다.
연구1. 커피박 추출물의 클로로겐산 함량 및 항산화능 측정
연구2. 커피박 추출물이 콩과 식물의 생장에 미치는 영향 분석
연구3. 콩과 식물을 식재한 토양의 마이크로바이옴 분석
저희가 이번 연구를 진행하며 작동 방법을 배우는데 가장 많은 시간을 투자했던 심화기기는 클로로겐산 함량을 측정할 때 사용한 HPLC(High-Performance Liquid Chromatography)입니다. 팀원 모두 R&E 대회 전에는 한 번도 연구를 해본 경험이 없었기에 이 기기를 다룰 수 있는 사람 또한 없었습니다. 하지만 HPLC는 초심자가 쓰기엔 꽤 어려운 기기였고, 분석하고자 하는 시료마다 원하는 결과를 얻기 위해서는 여러 실험 조건을 반복 실험을 통해 직접 알아내야 했습니다. 처음에는 HPLC를 이용하여 실험을 진행하는 것이 너무 어렵고, 결과를 내기 어려울 것 같아 다른 방법으로 클로로겐산의 함량을 측정하기로 하였습니다. 그것이 바로 Folin-Ciocalteu입니다.
Folin-Ciocalteu 방법은 폴리페놀 농도를 측정하는데 사용되는 화학적 분석 방법으로, 폴리페놀류의 화학반응을 기반으로 변화된 색상의 흡광도를 측정하여 폴리페놀의 농도를 결정할 수 있어서 다른 실험에 비해 폴리페놀의 총량을 빠르고 간편하게 측정할 수 있다는 장점이 있습니다. 하지만 폴리페놀의 정확한 정량값을 얻지 못하고, 폴리페놀에 함유된 클로로겐산을 특정지어 함량을 구할 수 없습니다. 저희는 이번 연구에서 클로로겐산의 함량을 정량적으로 구하는 것이 매우 중요하다고 판단하여 Folin-Ciocalteu 방법은 한계가 있다고 생각했습니다. 그래서 심화기기 연수를 통하여 HPLC의 사용법을 익히기로 결정하였습니다. 장장 7시간의 연수 끝에, HPLC를 모두가 다룰 수 있게 되었습니다. 배울 기회가 많지 않은 심화기기를 직접 실험에 이용하며 알게 되어 너무나 특별한 경험을 쌓을 수 있었습니다.
그러나 HPLC를 활용하는 방법을 익히는 것만으로 저희가 원하는 결과를 바로 얻을 수는 없었습니다. HPLC를 이용하여 특정 물질을 찾으려면 표준시료가 필요하기 때문입니다. 그래서 저희는 검색을 통해 여러 사이트에서 클로로겐산의 다양한 표준시료를 찾았습니다. 하지만 수많은 시료들 중에서 저희 실험에 적합하게 가공된 시료를 찾는 것이 문제였습니다. 같은 물질의 시료라도 사용되는 기기에 따라 양과 가격이 천차만별이었고, 전문용어로 설명되어 있어 원하는 시료를 찾는 데 어려움이 있었습니다. 이 과정에서 지도교사 선생님의 도움으로 어떤 것이 HPLC용인지, 양은 얼마나 필요한지 등을 배울 수 있었고, 무사히 시료를 구입할 수 있었습니다. 이번 경험을 통해 직접 실험을 진행해야 알 수 있는 것들이 있고, 나중에 다른 연구를 진행할 때에도 실험에 필요한 재료들을 상세히 고려해야 더욱 정확한 연구 계획을 세울 수 있다는 깨달음을 얻었습니다.
또한 HPLC는 액체 크로마토그래피이기 때문에 추출하고자 하는 시료에 따라 다른 용매를 사용해야 합니다. 커피박은 지용성 물질이기 때문에 유기용매를 사용하기로 했고, 여러 선행 연구들을 찾아보며 메탄올과 아세토나이트릴(ACN)이 유기용매로 많이 사용되고 있음을 알게 되었습니다. 처음에는 메탄올과 증류수를 용매로 사용했는데, 추출 단계가 너무 늦어져서 클로로겐산의 피크가 제대로 나타나지 않았습니다. 이후에 메탄올을 아세토나이트릴로 바꿔서 실험한 결과, 클로로겐산의 피크가 잘 분리되었고, 보다 정확한 결과 값을 얻을 수 있었습니다.
다음으로 콩과 식물의 생장 실험이 있었습니다. 저희는 콩과 식물 중에서도 키우기 쉽고, 주변에서 많이 볼 수 있는 강낭콩, 렌틸콩, 완두콩을 사용하였습니다. 2주 동안 콩 종류마다 3개씩 각 화분에 심어 키웠기 때문에, 날짜와 시간을 기준으로 물 주기 당번을 정해 연구를 진행하였습니다. 콩이 모두 자라고 났을 때는 육안으로 줄기의 길이 차이를 볼 수 있었습니다. 자를 이용하여 길이 수치 데이터를 얻은 후 선형회귀 분석을 하였습니다. 그 후 줄기를 건조시켜 중량도 측정해서 비교하였습니다.
콩나물의 생장 실험은 약간의 고난이 있었습니다. 콩나물 150개의 줄기 길이를 모두 직접 측정해야 했기 때문입니다. 심지어 콩나물이 구불구불해서 콩나물을 조심히 잡아당긴 후 자로 재어야 정확한 길이를 측정할 수 있었기에 많은 시간이 소요되었지만, 서로 도와주며 진행하여 잘 마칠 수 있었습니다. HPLC 연수와 많은 실전 경험들로 이미 HPLC 달인이 되어 있었기 때문에 콩나물의 vitamin 함량 측정은 빠르게 진행할 수 있었습니다.
마지막으로 콩과 식물을 식재한 토양의 마이크로바이옴 분석입니다. 저희는 나름 순조롭게 연구가 진행되고 있었기 때문에 이 연구도 마찬가지로 원하는 결과를 바로 얻을 수 있을거라 생각했지만, 커피박 추출물의 항균 효과를 검증하기 위한 paper disc 실험에서 결과가 아예 나오지 않았습니다. 또 콩과 식물이 생장한 토양의 미생물 분석을 위해 진행한 sequencing 과정에서도 여러 배지에서 mix가 뜨며 연구에 아무 결과도 사용할 수 없었고, 시간만 날렸다는 생각이 들었습니다. 이 과정에서 팀원들 사이에 마찰이 생겼고, 최종 보고서 제출 마감까지 얼마 남지 않은 시기였기에 당황하기도 했습니다. 그러나 결과를 포기할 수 없다는 생각에 문제점을 찾아가며 재실험을 계속 반복했고, 다행스럽게도 다시 진행한 미생물 sequencing에서 깔끔한 data를 얻을 수 있었습니다. 포기하지 않고 서로 할 수 있다고 힘을 낸 덕분에 얻을 수 있던 결과인 것 같습니다.
연구를 진행하면서 가장 많이 했던 것은 선행 연구 분석과 연구별 연결성입니다. 선행 연구 분석을 꼼꼼히 하면서 저희 연구의 빈 부분을 메꿀 수 있었고, 다른 연구와의 차별성이 있음을 강조할 수 있었습니다. 특히 실시했던 사전 연구와 본 연구 모두 매끄럽게 조직되었음을 확인할 수 있었고, 이를 토대로 연구의 결론을 조직력 있게 작성할 수 있었습니다.
5. 실험 결론
4가지 원두의 커피박에 함유되어 있는 클로로겐산의 함량을 HPLC로 분석하여 정량화할 수 있었습니다. 이를 통해 온두라스 S.H.G. 커피박이 가장 높은 클로로겐산 함량을 가짐을 알아냈습니다.
또한 수용성 물질인 클로로겐산이 가진 특성을 토대로 콩과 식물의 생장에 도움을 줄 수 있다고 판단하여 직접 실험을 진행하였고, 그 결과 액상의 식물 영양제로서의 가치를 확인할 수 있었습니다. 특히 온두라스 S.H.G. 커피박을 이용하여 만든 액상 형태의 커피박 식물 영양제를 개발하여 콩과 식물 생장 실험을 진행하였습니다. 실험 결과로 보아, 항산화 작용을 하는 클로로겐산이 콩과 식물 생장에 긍정적 효과를 준다는 것을 증명하였습니다.
현재 많은 곳에서 커피박을 비료로 사용하고 있지만, 기존의 고형 커피박 비료는 생산 시에 필수적으로 발효 과정을 거쳐야 합니다. 하지만 저희가 만든 액상 형태의 커피박 식물 영양제는 발효를 진행하지 않고도 사용할 수 있기에 공정 시간이 매우 단축되고, 들어가는 비용 또한 크게 절감할 수 있습니다. 그리고 액상 비료의 물리/화학적 처리 공정에 클로로겐산의 항산화 작용이 반응성을 보이지 않아 항산화능을 유지할 수 있었습니다.
토양 미생물 분석 결과에서 특성이나 연관성이 명확하게 규명되지 않은 균들이 발견되었습니다. 이것으로 저희는 이후 해당 균이 콩과 식물의 생장에 미치는 영향에 관한 추가 연구의 필요성을 제기할 수 있게 되었습니다.
6. 발표대회를 준비하며
저희는 본 연구를 진행하며 2023 과학영재 창의연구(R&E) 대회에 연구 보고서를 작성하여 참여하였습니다. 연구 보고서 대회에서 합격한 저희는 바로 포스터 발표 대회를 준비하게 되었습니다. 연구 포스터 또한 처음 만드는 것이므로 막막했지만, 지도교사 선생님의 도움과 팀원 모두가 열심히 참여하여 근사한 포스터를 완성할 수 있었습니다. 발표를 준비할 때 지도교사 선생님을 통한 교수님과의 줌 회의를 진행하였는데, 그때 질의응답과 발표를 미리 해볼 수 있어 실제 대회에서 예상하지 못했던 질문에도 잘 대답할 수 있던 것 같습니다. 발표대회에서 심사위원님께서 던지신 질문에 저희 연구의 허점을 찾게 되었고, 수정하여 더욱 완성도 있는 논문을 작성할 수 있게 되었습니다. 지금까지 생각해보지 못한 관점에서 이야기를 들을 수 있어 연구의 보완해야 할 부분을 확실하게 알게 되었습니다.
느낀 점
인천과학고등학교 이동욱 커피를 매우 좋아합니다. 이 연구를 시작하게 된 동기도 학교에서 커피를 마시기 위해 커피 머신을 가져왔는데 커피박 처리 문제의 이유로 담임 선생님께서 학교에 가지고 오지 말라고 하셨습니다. 따라서 저는 커피박 처리 문제에 관해 연구하였고, 이번 연구를 통해 학교에서 커피를 마실 수 있게 되었습니다. 연구를 진행하면서 조원들과 의견 조율에 어려움도 있었습니다. 모두 각기 다른 생각을 가지고 있었고, 모두 하고 싶은 연구가 존재하였기 때문입니다. 이 때문에 주제 선택이 다른 조보다 늦었고, 실험도 늦게 진행되었습니다. 하지만 연구 방향성이 정해지자 모두 각자 위치에서 최선을 다하였고, 빠르게 저희 연구의 결론이 성공적으로 도출될 수 있었습니다.
인천과학고등학교 전나현 처음에는 마냥 연구활동을 한다는 것에 신이 났었는데, 막상 시작하고 보니 주제를 정하는 것부터 매우 힘들었습니다. 사실 마지막까지도 명확한 주제와 연구의 방향성을 잡지 못한 채 실험을 진행하기도 했었는데, 선행연구들을 열심히 분석한 결과 진행한 실험들 사이의 논리와 흐름을 이어주는 자료들을 찾을 수 있었습니다. 또한 1년이라는 긴 시간 동안 같은 팀으로 연구를 하며 의견이 맞지 않는 경우도 꽤 있었습니다. 하지만 서로 협력하고 의견을 조율하여 진짜로 하나의 팀이 되어가는 것을 느낄 수 있었습니다. 그리고 평소에 관심 있던 분야의 연구를 직접 진행해보면서 진로에 대해서 좀 더 깊이 있게 생각해볼 수 있었습니다. 연구를 진행하며 포기하고 싶은 순간도 분명히 있었지만 팀원들과 항상 함께였고, 끝까지 많은 것을 알려주신 지도교사 안지혜 선생님 덕분에 여기까지 올 수 있었던 것 같습니다.
인천과학고등학교 김준 우선 저희 팀원들과 담당 선생님께 감사 인사를 전하고 싶습니다. 처음 진행하는 연구였기에 미숙한 부분이 많았지만, 실수를 하더라도 괜찮다며 격려를 해주는 팀원들과 여러 조언을 해주셨던 담당 선생님이 계셨기에 좋은 성과를 낼 수 있었습니다. 또한 여러 격려와 조언 덕분에 1년이라는 긴 시간 동안 큰 탈 없이 연구를 진행하게 되었던 것 같습니다. 어려웠던 실험들도 이제는 흥미를 느끼게 되었고, 지금까지 진행헀던 실험들 이외에 다른 실험도 해보고 싶습니다. 1년이라는 시간 동안 힘든 시간도 있었지만, 저희가 노력하여 연구를 진행하게 됨에 따라 세계적으로 문제가 되고 있는 커피박 문제에 대한 해결책의 일부분을 제시하여 사람들의 도움이 될 수 있다는 생각에 힘이 났습니다. 또한 좋은 성과를 내어 환경적, 경제적으로도 우리 사회에 도움이 되었다고 생각하니 정말 자랑스럽습니다.
인천과학고등학교 김태욱 앞서 저희 팀을 지도해주신 안지혜 선생님에게 감사하다는 말을 하고 싶고 저희 팀원들에게도 고맙다는 말을 하고 싶습니다. 저희는 많은 얘기를 나누었는데 그때 언성이 잠깐 높아졌을 때도 있지만 그러한 일들이 저희에게 영향을 주어 더욱 좋은 주제를 찾을 수 있었던 것 같습니다. 실험을 진행하며 기기가 작동되지 않거나 실험의 오류로 많은 시행착오가 있었지만 팀원들이 같이 고민해주며 해결할 수 있었습니다. 제가 실험 중에 부족한 부분이 있어서 문제가 생기면 팀원들이 조언을 해주며 도와준 것이 고마웠습니다. 연구를 진행하며 새로운 지식을 얻게 되고 그와 관련된 부족한 연구들이 많다는 것이 생각되었고 추후에 추가로 연구해보고 싶다고 생각하였습니다.
인천과학고등학교 이희율 R&E 활동을 하면서 연구 주제는 물론, 연구 방법 및 필요한 학습 수준까지 이 모든 걸 우리 스스로가 결정해야 한다는 부담감이 컸습니다. 그래서 처음에는 막막했고, 연구 결과를 내야 한다는 압박감도 있었습니다. 그래도 연구에 직접 뛰어들어 만족할 만한 연구 결과를 낼 수 있었던 것 같습니다. 저희는 연구 결과가 잘 나오지 않아 모두가 막막해하는 상황에서도 항상 긍정적으로 생각하며 서로를 복돋아 주었습니다. 이 덕분에 스스로 결정해야 한다는 부담감은 점차 스스로 '할 수 있다'라는 즐거움으로 바뀌어 갔습니다. 이후, 막연하던 연구는 점차 구체화 되었고 필요한 부분은 함께 협력하면서 즐겁게 연구를 끝마칠 수 있었던 것 같습니다. 우리 조원 모두와 끝까지 아낌없는 조언을 해주셨던 지도 선생님 모두에게 감사한다고 전하고 싶습니다. 끝까지 포기하지 않았기에, 그보다도 서로를 믿고 즐겁게 연구를 할 수 있었기에 결과를 떠나 R&E는 정말 연구 자체를 즐길 수 있던 귀중한 경험이었던 것 같습니다.